جداسازی و بررسی میزان فعالیت آنزیم پروتئاز در باسیلوس های جداسازی شده از چشمه‌های آب گرم محلات

نوع مقاله : علوم جانوری

نویسندگان

1 موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، شعبه اراک، ایران

2 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد بروجرد، دانشگاه آزاد اسلامی، بروجرد، ایران

چکیده

پروتئازها پرمصرف‌ترین آنزیم‌های صنعتی هستند که کاربردهای زیادی در زیست‌فناوری دارند. به‌طوری ­که حدود ۶۰ درصد از بازار جهانی آنزیم‌های صنعتی را به­ خود اختصاص داده‌اند. میکروب‌ها به ­دلیل رشد سریع، سهولت کشت، دستکاری ژنتیکی در جهت تولید بهینه آنزیم، از منابع عمده تولید پروتئازها به ­شمار می‌روند. این مطالعه با هدف جداسازی گونه‌های باسیلوس گرمادوست مولد آنزیم پروتئاز از چشمه‌های آب گرم محلات واقع در استان مرکزی و ارزیابی قابلیت تولید آنزیم پروتئاز در این گونه‌ها انجام شده است. به‌منظور جداسازی و شناسایی اولیه میکروارگانیسم‌های دارای فعالیت پروتئولیتیک از محیط کشت Skim milk agar همراه با آزمون‌های بیوشیمیایی استفاده شد. وجود ژن پروتئاز در گونه‌های باکتریایی با روش PCR بررسی گردید و جهت تشخیص گونه‌های باکتریایی ژن 16 SrRNA به روش PCR تکثیر و تعیین توالی گردید. سنجش فعالیت پروتئاز به روش لوری صورت گرفت و بهترین گونه باسیلوس ازنظر فعالیت پروتئاز شناسایی گردید. ۹ گونه باکتریایی توسط تست‌های بیوشیمیایی به‌عنوان گونه‌های برتر مولد آنزیم پروتئاز جداسازی شدند. در بررسی بیان ژن پروتئاز و توالی یابی ژن 16 SrRNA، ۷ گونه باکتریایی بیش ­ترین قرابت را با گونه‌های باسیلوس نشان دادند. در سنجش فعالیت آنزیم به ­ترتیب سه گونه باکتریایی DA3، DA2 و BN2 در دمای ۴۷ درجه سانتی‌گراد و در pH معادل ۸ بیش ­ترین فعالیت را داشتند. با توجه به کاربردهای فراوان آنزیم پروتئاز در صنعت به ­نظر می‌رسد استفاده از سویه‌های محلی می‌تواند در دستیابی به تولید بالای آنزیم پروتئاز و بی‌نیازی کشور به واردات این محصول مفید واقع شود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Isolation and protease enzyme activity survey in Bacillus isolates collected from Mahalat warm water springs

نویسندگان [English]

  • Seyed Davood Hosseini 1
  • Marzieh Hesaree 2
1 Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Training and Promotion Organization, Arak Branch, Iran
2 Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Boroujerd Branch, Islamic Azad University, Boroujerd, Iran
چکیده [English]

Protease enzymes are the most commonly used industrial enzymes which have numerous applications in biotechnology. These enzymes have allocated about%60 of the world market industrial enzymes to themselves. Microbes are considered as one of the main sources for producing Protease due to their rapid growth, cultivation ease, and genetic manipulation for optimizing enzymes production. The present study aims to isolate the thermophilic species of Protease-producing Bacillus from Mahallat hot springs in Markazi province and to evaluate the capability for producing Protease enzyme in these species.The initial isolation and identification process was carried out using biochemical tests along with microorganisms with Proteolytic enzyme activity from the Skim milk agar culture. The presence of Protease gene in bacteria species was evaluated using PCR cloning and to identify bacterial species 16 SrRNA gene was amplified by PCR and sequenced. Protease activity was assessed using Lowry test. Finally, the best Bacillus species was detected in terms of Protease activity. 9 bacteria species were selected and isolated as the superior Protease-producing enzyme species using biochemical tests. The analysis of Protease gene and 16 SrRNA gene sequencing indicated that 7 bacteria species have the most proximity to Bacillus species. In enzyme activity assessment, three bacteria species including BN2, DA2, and DA3 demonstrated the highest activity at 47˚C, pH=8, respectively.Due to Protease enzyme various applications in industry, it seems that the use of local strains can help large scale production of Protease enzyme and our country’s self-sufficiency to import this product.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Protease Enzyme
  • Bacillus
  • proteolytic
  • Thermal Resistance
  • Isolation
  1. بدویی ­دلفارد، ا.؛ امیری، پ.؛ رمضانی ­پور، ن.؛ کرمی، ز. و قنبری،ب.،۱۳۹۴. تولید پروتئاز قلیایی توسط باسیلوس تیکیولنسس سویه FJSH2 جداشده از فاضلاب کشتارگاه دام جیرفت. مجله دنیای میکروب‌ها. سال 8، شماره 1، صفحات 54 تا 63.
  2. Abdel-Naby, M.A.; Ahmed, S.A.; Wehaidy, H.R. and El Mahdy, S.A., 2017. Catalytic, kinetic and thermodynamic properties of stabilized Bacillus stearothermophilus alkaline protease. Int J Biol Macromol. Vol. 96, pp: 265-271.
  3. Bajaj, B.K. and Jamwal, G., 2013. Thermostable alkaline protease production from Bacillus pumilus D-6 by using agro-residues as substrates. Advances in Enzyme Research. Vol. 1, No. 2, pp: 30-36.
  4. Baron, E.J. and Finegold, S.M., 1990. Baily and Scott’s Diagnostic Microbiology. 8nd Ed. The Mosby Company, C.V. St. Louis, Baltmore, Philadelphia, Toronto. pp: 451-456.
  5. Cupp-Enyard, C., 2008. Sigma's non-specific protease activity assay-casein as a substrate. JoVE. Vol. 19, pp: 899.
  6. De Azeredo, L.; Freire, D.; Soares, R.; Leite, S. and Coelho, R., 2004. Production and partial characterization of thermophilic proteases from Streptomyces sp. isolated from Brazilian cerrado soil. Enzyme and Microbial Technology. Vol. 34, No. 3, pp: 354-358.
  7. Dubal, S.A.; Tilkari, Y.P.; Momin, S. and Borkar, I.V., 2008. Biotechnological routes in flavour industries. Eendo. pp: 14-15.
  8. Feng, Y.; Yang, W.; Ong, S.; Hu, J. and Ng, W., 2001. Fermentation of starch for enhanced alkaline protease production by constructing an alkalophilic Bacillus pumilus strain. Applied microbiology and biotechnology. Vol. 57, No. 1-2, pp: 153-160.
  9. Haddar, A.; Fakhfakh-Zouari, N.; Hmidet, N.; Frikha, F.; Nasri, M. and Kamoun, A.S., 2010. Low-cost fermentation medium for alkaline protease production by Bacillus mojavensis A21 usinghulled grain of wheat and sardinella peptone. Journal of bioscience and bioengineering. Vol. 110, No. 3, pp: 288-294.
  10. Mehak, B.; Rameshwar, T.;Puneet, K.; Lata, N. and Pratyoosh, S., 2016. An Alkaline Protease from Bacillus pumilus MP 27: Functional Analysis of Its Binding Model toward Its Applications As Detergent Additive. Vol. 7, 1195 p.
  11. Joo, H.S. and Chang, C.S., 2005. Oxidant and SDS‐stable alkaline protease from a halo‐tolerant Bacillus clausii I‐52: enhanced production and simple purification. Journal of applied microbiology. Vol. 98, No. 2, pp: 491-497.
  12. Kuberan, T.; Sangaralingam, S. and Thirumalaiarasu, V., 2010. Isolation and optimization of Protease producing Bacteria from Halophilic soil. Journal of the belgian society of radiology. Vol. 1, No. 3, pp: 163-174.
  13. Kumar, R. and Vats, R., 2010. Protease production by Bacillus subtilis immobilized on different matrices. New York Science Journal. Vol. 3, No. 7, pp: 20-24.
  14. Marnett, A.B. and Craik, C.S., 2005. Papa's got a brand new tag: advances in identification of proteases and their substrates. Trends in biotechnology. Vol. 23, No. 2, pp: 59-64.
  15. Manni, L.; Jellouli, K.; Ghorbel-Bellaaj, O.; Agrebi, R. and Haddar, A., 2010. An oxidant-and solvent-stable protease produced by Bacillus cereus SV1: application in the deproteinization of shrimp wastes and as a laundry detergent additive. Applied biochemistry and biotechnology. Vol. 160, No. 8, pp: 2308-2321.
  16. Mehta, V.J.; Thumar, J.T. and Singh, S.P., 2006. Production of alkaline protease from an alkaliphilic actinomycete. Bioresource technology. Vol. 97, No. 14, pp: 1650-1654.
  17. Navarrete, A.A.; Barreto, C.C.; Arnaldo, M. and Tsai, S.M., 2013. Molecular detection on culture medium of Acidobacteria from Amazon soils. Microbiology Discovery. Vol. 1, No. 1, pp: 1-9.
  18. Olajuyigbe, F.M. and Ehiosun, K.I., 2013. Production of thermostable and organic solvent-tolerant alkaline protease from Bacillus coagulans PSB-07 under different submerged fermentation conditions. African journal of biotechnology. Vol. 12, No. 21, pp: 3341-3350.
  19. Omidinia, E.; Mashayekhi Mazar, F.; Shahbaz Mohammadi, H.; Ebrahimi-Rad, M. and Gregorian, A., 2012. Isolation, purification and characterization of a thermophilic alkaline protease from Bacillus subtilis BP-36. Journal of Sciences. Vol. 23, No. 1, pp: 7-13.
  20. Oskouie, S.F.G.; Tabandeh, F.; Yakhchali, B. and Eftekhar, F., 2007. Enhancement of alkalineprotease production by Bacillus clausii using Taguchi experimental design. African journal of biotechnology. Vol. 6, No. 22, pp: 2559-2564.
  21. Pant, G.; Prakash, A.; Pavani, J.V.P.; Bera, S. and Deviram, G.V.N.S., 2015. Production, optimization and partial purification of protease from Bacillus subtilis. Journal of taibah university for science. Vol. 9, No. 1, pp: 50-55.
  22. Schilling, O. and Overall, C.M., 2008. Proteome-derived, database-searchable peptide libraries for identifying protease cleavage sites. Nature biotechnology. Vol. 26, No. 6, pp: 685-694.
  23. Sekhon, B.S., 2010. Food nanotechnology–an overview. Nanotechnology, science and applications. Vol. 3, No. 1, pp: 1-15.
  24. Sharma, A. and Tiwari, R., 2005. Extracellular enzyme production by environmental strains of Serratia spp. isolated from river Narmada. Indian journal of biochemistry and biophysics. Vol. 42, No. 3, pp: 178-181.
  25. Sizova, M.V.; Hohmann, T.; Hazen, A.; Paster, B.J.; Halem, S.R.; Murphy, C.M.; Panikov, N.S. and Epstein, S.S.; 2012. New Approaches for Isolation of Previously Uncultivated Oral Bacteria. Applied and environmental microbiology. Vol. 78, No. 1, pp: 194-203.
  26. Sneath, P.H.A.; Sharpe, M.E. and Holt, J.G., 1984. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. First Ed. Vol. 2, The Williams & Wilkins Company, 428 E. Preston St, Baltimore, USA. pp: 1104-1139.
  27. Starcher, B., 2001. A ninhydrin-based assay to quantitate the total protein content of tissue samples. Analytical biochemistry. Vol. 292, No. 1, pp: 125-129.
  28. Suganthi, C.; Mageswari, A.; Karthikeyan, S.; Anbalagan,M.; Sivakumar, A. and Gothandam, K.M., 2013. Screening and optimization of protease production from a halotolerant Bacillus licheniformis isolated from saltern sediments. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. Vol. 11, No. 1, pp: 47-52.
  29. Takenaka, S.; Yoshida, N.; Yoshida, K.; Murakami, S. and Aoki, K., 2011. Molecular cloning and sequence analysis of two distinct halotolerant extracellular proteases from Bacillus subtilisFP-133. Bioscience, biotechnology and biochemistry. Vol. 75, No. 1, pp: 148-151.
  30. Vijayalakshmi, S.; Venkat Kumar, S. and Thankamani, V., 2011. Optimization and cultural characterization of Bacillus RV. B2. 90 producing alkalophilic thermophilic protease. Research Journal of Biotechnology. Vol. 6, pp: 26-32.
  31. Yamane, K.; Bunai, K. and Kakeshita, H., 2004. Protein traffic for secretion and related machinery of Bacillus subtilis. Bioscience, biotechnology and biochemistry. Vol. 68, No. 10, pp: 2007 -2023.
  32. Yildirim, V.; Baltaci, M.O.; Ozgencli, I.; Sisecioglu, M.; Adiguzel, A. and Adiguzel, G., 2017. Purification and biochemical characterization of a novel thermostable serine alkaline protease from Aeribacillus pallidus C10: a potential additive for detergents. J Enzyme Inhib Med Chem. Vol. 32, pp: 468-477.