جداسازی و بررسی میزان فعالیت آنزیم پروتئاز در باسیلوس های جداسازی شده از چشمه‌های آب گرم محلات

نوع مقاله: علوم جانوری

نویسندگان

1 موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، شعبه اراک، ایران

2 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد بروجرد، دانشگاه آزاد اسلامی، بروجرد، ایران

چکیده

پروتئازها پرمصرف‌ترین آنزیم‌های صنعتی هستند که کاربردهای زیادی در زیست‌فناوری دارند. به‌طوری ­که حدود ۶۰ درصد از بازار جهانی آنزیم‌های صنعتی را به­ خود اختصاص داده‌اند. میکروب‌ها به ­دلیل رشد سریع، سهولت کشت، دستکاری ژنتیکی در جهت تولید بهینه آنزیم، از منابع عمده تولید پروتئازها به ­شمار می‌روند. این مطالعه با هدف جداسازی گونه‌های باسیلوس گرمادوست مولد آنزیم پروتئاز از چشمه‌های آب گرم محلات واقع در استان مرکزی و ارزیابی قابلیت تولید آنزیم پروتئاز در این گونه‌ها انجام شده است. به‌منظور جداسازی و شناسایی اولیه میکروارگانیسم‌های دارای فعالیت پروتئولیتیک از محیط کشت Skim milk agar همراه با آزمون‌های بیوشیمیایی استفاده شد. وجود ژن پروتئاز در گونه‌های باکتریایی با روش PCR بررسی گردید و جهت تشخیص گونه‌های باکتریایی ژن 16 SrRNA به روش PCR تکثیر و تعیین توالی گردید. سنجش فعالیت پروتئاز به روش لوری صورت گرفت و بهترین گونه باسیلوس ازنظر فعالیت پروتئاز شناسایی گردید. ۹ گونه باکتریایی توسط تست‌های بیوشیمیایی به‌عنوان گونه‌های برتر مولد آنزیم پروتئاز جداسازی شدند. در بررسی بیان ژن پروتئاز و توالی یابی ژن 16 SrRNA، ۷ گونه باکتریایی بیش ­ترین قرابت را با گونه‌های باسیلوس نشان دادند. در سنجش فعالیت آنزیم به ­ترتیب سه گونه باکتریایی DA3، DA2 و BN2 در دمای ۴۷ درجه سانتی‌گراد و در pH معادل ۸ بیش ­ترین فعالیت را داشتند. با توجه به کاربردهای فراوان آنزیم پروتئاز در صنعت به ­نظر می‌رسد استفاده از سویه‌های محلی می‌تواند در دستیابی به تولید بالای آنزیم پروتئاز و بی‌نیازی کشور به واردات این محصول مفید واقع شود.

کلیدواژه‌ها


  1. بدویی ­دلفارد، ا.؛ امیری، پ.؛ رمضانی ­پور، ن.؛ کرمی، ز. و قنبری،ب.،۱۳۹۴. تولید پروتئاز قلیایی توسط باسیلوس تیکیولنسس سویه FJSH2 جداشده از فاضلاب کشتارگاه دام جیرفت. مجله دنیای میکروب‌ها. سال 8، شماره 1، صفحات 54 تا 63.
  2. Abdel-Naby, M.A.; Ahmed, S.A.; Wehaidy, H.R. and El Mahdy, S.A., 2017. Catalytic, kinetic and thermodynamic properties of stabilized Bacillus stearothermophilus alkaline protease. Int J Biol Macromol. Vol. 96, pp: 265-271.
  3. Bajaj, B.K. and Jamwal, G., 2013. Thermostable alkaline protease production from Bacillus pumilus D-6 by using agro-residues as substrates. Advances in Enzyme Research. Vol. 1, No. 2, pp: 30-36.
  4. Baron, E.J. and Finegold, S.M., 1990. Baily and Scott’s Diagnostic Microbiology. 8nd Ed. The Mosby Company, C.V. St. Louis, Baltmore, Philadelphia, Toronto. pp: 451-456.
  5. Cupp-Enyard, C., 2008. Sigma's non-specific protease activity assay-casein as a substrate. JoVE. Vol. 19, pp: 899.
  6. De Azeredo, L.; Freire, D.; Soares, R.; Leite, S. and Coelho, R., 2004. Production and partial characterization of thermophilic proteases from Streptomyces sp. isolated from Brazilian cerrado soil. Enzyme and Microbial Technology. Vol. 34, No. 3, pp: 354-358.
  7. Dubal, S.A.; Tilkari, Y.P.; Momin, S. and Borkar, I.V., 2008. Biotechnological routes in flavour industries. Eendo. pp: 14-15.
  8. Feng, Y.; Yang, W.; Ong, S.; Hu, J. and Ng, W., 2001. Fermentation of starch for enhanced alkaline protease production by constructing an alkalophilic Bacillus pumilus strain. Applied microbiology and biotechnology. Vol. 57, No. 1-2, pp: 153-160.
  9. Haddar, A.; Fakhfakh-Zouari, N.; Hmidet, N.; Frikha, F.; Nasri, M. and Kamoun, A.S., 2010. Low-cost fermentation medium for alkaline protease production by Bacillus mojavensis A21 usinghulled grain of wheat and sardinella peptone. Journal of bioscience and bioengineering. Vol. 110, No. 3, pp: 288-294.
  10. Mehak, B.; Rameshwar, T.;Puneet, K.; Lata, N. and Pratyoosh, S., 2016. An Alkaline Protease from Bacillus pumilus MP 27: Functional Analysis of Its Binding Model toward Its Applications As Detergent Additive. Vol. 7, 1195 p.
  11. Joo, H.S. and Chang, C.S., 2005. Oxidant and SDS‐stable alkaline protease from a halo‐tolerant Bacillus clausii I‐52: enhanced production and simple purification. Journal of applied microbiology. Vol. 98, No. 2, pp: 491-497.
  12. Kuberan, T.; Sangaralingam, S. and Thirumalaiarasu, V., 2010. Isolation and optimization of Protease producing Bacteria from Halophilic soil. Journal of the belgian society of radiology. Vol. 1, No. 3, pp: 163-174.
  13. Kumar, R. and Vats, R., 2010. Protease production by Bacillus subtilis immobilized on different matrices. New York Science Journal. Vol. 3, No. 7, pp: 20-24.
  14. Marnett, A.B. and Craik, C.S., 2005. Papa's got a brand new tag: advances in identification of proteases and their substrates. Trends in biotechnology. Vol. 23, No. 2, pp: 59-64.
  15. Manni, L.; Jellouli, K.; Ghorbel-Bellaaj, O.; Agrebi, R. and Haddar, A., 2010. An oxidant-and solvent-stable protease produced by Bacillus cereus SV1: application in the deproteinization of shrimp wastes and as a laundry detergent additive. Applied biochemistry and biotechnology. Vol. 160, No. 8, pp: 2308-2321.
  16. Mehta, V.J.; Thumar, J.T. and Singh, S.P., 2006. Production of alkaline protease from an alkaliphilic actinomycete. Bioresource technology. Vol. 97, No. 14, pp: 1650-1654.
  17. Navarrete, A.A.; Barreto, C.C.; Arnaldo, M. and Tsai, S.M., 2013. Molecular detection on culture medium of Acidobacteria from Amazon soils. Microbiology Discovery. Vol. 1, No. 1, pp: 1-9.
  18. Olajuyigbe, F.M. and Ehiosun, K.I., 2013. Production of thermostable and organic solvent-tolerant alkaline protease from Bacillus coagulans PSB-07 under different submerged fermentation conditions. African journal of biotechnology. Vol. 12, No. 21, pp: 3341-3350.
  19. Omidinia, E.; Mashayekhi Mazar, F.; Shahbaz Mohammadi, H.; Ebrahimi-Rad, M. and Gregorian, A., 2012. Isolation, purification and characterization of a thermophilic alkaline protease from Bacillus subtilis BP-36. Journal of Sciences. Vol. 23, No. 1, pp: 7-13.
  20. Oskouie, S.F.G.; Tabandeh, F.; Yakhchali, B. and Eftekhar, F., 2007. Enhancement of alkalineprotease production by Bacillus clausii using Taguchi experimental design. African journal of biotechnology. Vol. 6, No. 22, pp: 2559-2564.
  21. Pant, G.; Prakash, A.; Pavani, J.V.P.; Bera, S. and Deviram, G.V.N.S., 2015. Production, optimization and partial purification of protease from Bacillus subtilis. Journal of taibah university for science. Vol. 9, No. 1, pp: 50-55.
  22. Schilling, O. and Overall, C.M., 2008. Proteome-derived, database-searchable peptide libraries for identifying protease cleavage sites. Nature biotechnology. Vol. 26, No. 6, pp: 685-694.
  23. Sekhon, B.S., 2010. Food nanotechnology–an overview. Nanotechnology, science and applications. Vol. 3, No. 1, pp: 1-15.
  24. Sharma, A. and Tiwari, R., 2005. Extracellular enzyme production by environmental strains of Serratia spp. isolated from river Narmada. Indian journal of biochemistry and biophysics. Vol. 42, No. 3, pp: 178-181.
  25. Sizova, M.V.; Hohmann, T.; Hazen, A.; Paster, B.J.; Halem, S.R.; Murphy, C.M.; Panikov, N.S. and Epstein, S.S.; 2012. New Approaches for Isolation of Previously Uncultivated Oral Bacteria. Applied and environmental microbiology. Vol. 78, No. 1, pp: 194-203.
  26. Sneath, P.H.A.; Sharpe, M.E. and Holt, J.G., 1984. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. First Ed. Vol. 2, The Williams & Wilkins Company, 428 E. Preston St, Baltimore, USA. pp: 1104-1139.
  27. Starcher, B., 2001. A ninhydrin-based assay to quantitate the total protein content of tissue samples. Analytical biochemistry. Vol. 292, No. 1, pp: 125-129.
  28. Suganthi, C.; Mageswari, A.; Karthikeyan, S.; Anbalagan,M.; Sivakumar, A. and Gothandam, K.M., 2013. Screening and optimization of protease production from a halotolerant Bacillus licheniformis isolated from saltern sediments. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. Vol. 11, No. 1, pp: 47-52.
  29. Takenaka, S.; Yoshida, N.; Yoshida, K.; Murakami, S. and Aoki, K., 2011. Molecular cloning and sequence analysis of two distinct halotolerant extracellular proteases from Bacillus subtilisFP-133. Bioscience, biotechnology and biochemistry. Vol. 75, No. 1, pp: 148-151.
  30. Vijayalakshmi, S.; Venkat Kumar, S. and Thankamani, V., 2011. Optimization and cultural characterization of Bacillus RV. B2. 90 producing alkalophilic thermophilic protease. Research Journal of Biotechnology. Vol. 6, pp: 26-32.
  31. Yamane, K.; Bunai, K. and Kakeshita, H., 2004. Protein traffic for secretion and related machinery of Bacillus subtilis. Bioscience, biotechnology and biochemistry. Vol. 68, No. 10, pp: 2007 -2023.
  32. Yildirim, V.; Baltaci, M.O.; Ozgencli, I.; Sisecioglu, M.; Adiguzel, A. and Adiguzel, G., 2017. Purification and biochemical characterization of a novel thermostable serine alkaline protease from Aeribacillus pallidus C10: a potential additive for detergents. J Enzyme Inhib Med Chem. Vol. 32, pp: 468-477.