بهینه سازی تولید یک آنزیم پروتئازخارج سلولی قلیادوست مقاوم به حلال آلی ترشح شده از یک سویه باسیلوس

نوع مقاله: سایر

نویسندگان

گروه بیولوژی، دانشکده علوم، دانشگاه رازی، کرمانشاه، ایران

چکیده

هدف در این پژوهش بهینه ­سازی تولید آنزیم پروتئاز قلیادوست مقاوم به حلال آلی از یک سویه باسیلوس و تعیین خصوصیات آنزیم می ­باشد. در این پژوهش یک سویه باسیلوس از چشمه‌ آبگرم جداسازی شد و در محیط غنی شده با سیکلوهگزان (30%) و تولوئن (10%) رشد یافت. باکتری‌های تولیدکننده پروتئاز با استفاده از کلنی‌های رشد یافته روی پلیت‌های اسکیم میلک آگار (SMA) جداسازی شدند. آنزیم پروتئاز در روش دو مرحله‌ای شامل رسوب ­دهی با سولفات آمونیوم و کروماتوگرافی تعویض آنیونی DEAE- سفارز به شکل جزیی تخلیص شد. در نهایت یکی از کلنی‌ها به ­عنوان بهترین سویه با فعالیت پروتئازی معرفی شد. برای بهینه ­سازی محیط کشت باکتری برای تولید حداکثر پروتئاز فاکتورهای مختلف ازجمله زمان گرماگذاری، دما، اسیدیته، منابع کربن و منابع نیتروژن آزمایش شد. بیش ­ترین بازده رشد باکتریایی و تولید پروتئاز پس از 72 ساعت گرماگذاری در دمای37 درجه سانتی ­گراد و  اسیدیته 7 زمانی که محیط کشت توسط منبع کربنی سوکروز و منبع نیتروژن عصاره مخمر 5 درصد غنی شده بود، مشاهده شد. این پروتئاز بیش‌ترین فعالیت را در دمای 50 درجه سانتی­ گراد و اسیدیته 10 نشان داد و توسط اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) مهار شد، اما توسط مهارکننده‌های سرین پروتئاز تحت تأثیر قرار نگرفت که پیشنهاد می‌کند این آنزیم یک متالوپروتئاز است. فعالیت آنزیم در حضور غلظت 10% (v/v)از تولوئن، متانول، اتانول و دیاتیلاتر افزایش یافت. بنابراین، آنزیم می ­تواند به ­عنوان یک بیوکاتالیست قوی در صنایع و بیوتکنولوژی به­ کار گرفته شود.

کلیدواژه‌ها


  1. Akel, H.; Al-Quadan, F. and Yousef, T.K., 2009. Characterization of a purified thermostable protease from hyperthermophilic Bacillus strain HUTBS71. Eur J Sci Res. Vol. 31, No. 2, pp: 280-288.
  2. Badoei-Dalfard, A. and Karami, Z., 2013. Screening and isolation of an organic solvent tolerant-protease from Bacillus sp. JER02: activity optimization by response surface methodology. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. Vol. 89, pp: 15-23.
  3. Beg, Q.K. and Gupta, R., 2003. Purification and characterization of an oxidation-stable, thiol-dependent serine alkaline protease from Bacillus mojavensis. Enzyme and Microbial Technology. Vol. 32, No. 2, pp: 294-304.
  4. Deng, A.; Wu, J.; Zhang, Y.; Zhang, G. and Wen, T., 2010. Purification and characterization of a surfactant stable high-alkaline protease from Bacillus sp. B001. Bioresource technology. Vol. 101, No. 18, pp: 7100-7106.
  5. El Hadj-Ali, N.; Agrebi, R.; Ghorbel-Frikha, B.; Sellami Kamoun, A.; Kanoun, S. and Nasri, M., 2007. Biochemical and molecular characterization of a detergent stable alkaline serine-protease from a newly isolated Bacillus licheniformis NH1. Enzyme and Microbial Technology. Vol. 40, No. 4, pp: 515-523.
  6. Ghorbel-Frikha, B.; Sellami-Kamoun, A.; Fakhfakh, N.; Haddar, A.; Manni, L. and Nasri, M., 2005. Production and purification of a calcium-dependent protease from Bacillus cereus BG1. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. Vol. 32, No. 5, pp: 186-194.
  7. Gupta, R.; Beg, Q. and Lorenz, P., 2002. Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications. Applied microbiology and biotechnology. Vol. 59, No. 1, pp: 15-32.
  8. Hawumba, J.F.; Theron, J. and Brözel, V.S., 2002. Thermophilic protease-producing Geobacillus from Buranga hot springs in Western Uganda. Current microbiology. Vol. 45, No. 2, pp: 144-150.
  9. Hutadilok-Towatana, N.; Painupong, A. and Suntinanalert, P., 1999. Purification and characterization of an extracellular protease from alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp. PS719. Journal of bioscience and bioengineering. Vol. 87, No. 5, pp: 581-587.
  10. Jellouli, K.; Ghorbel-Bellaaj, O.; Ayed, H.B.; Manni, L.; Agrebi, R. and Nasri, M., 2011. Alkaline-protease from Bacillus licheniformis MP1: purification, characterization and potential application as a detergent additive and for shrimp waste deproteinization. Process Biochemistry. Vol. 46, No. 6, pp: 1248-1256.
  11. Johnvesly, B. and Naik, G., 2001. Studies on production of thermostable alkaline protease from thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp. JB-99 in a chemically defined medium. Process biochemistry. Vol. 37, No. 2, pp: 139-144.
  12. Kalisz, H. and Fisher, A., 1988. Microbial Proteinases, Advances in Biochemical Engineering Biotechnology.
  13. Kaur, S.; Vohra, R.; Kapoor, M.; Beg, Q.K. and Hoondal, G., 2001. Enhanced production and characterization of a highly thermostable alkaline protease from Bacillus sp. P-2. World Journal of Microbiology and Biotechnology. Vol. 17, No. 2, pp: 125-129.
  14. Kumar, C.G.; Joo, H.S.; Koo, Y.M.; Paik, S.R. and Chang, C.S., 2004. Thermostable alkaline protease from a novel marine haloalkalophilic Bacillus clausii isolate. World Journal of Microbiology and Biotechnology. Vol. 20, No. 4, pp: 351-357.
  15. Kumar, C.G. and Takagi, H., 1999. Microbial alkaline proteases: from a bioindustrial viewpoint. Biotechnology advances. Vol. 17, No. 7, pp: 561-594.
  16. Lowry, O.H.; Rosebrough, N.J.; Farr, A.L. and Randall, R.J., 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of biological chemistry. Vol. 193, pp: 265-275.
  17. Lutz, G.; Chavarría, M.; Arias, M.L. and Mata-Segreda, J.F., 2006. Microbial degradation of palm (Elaeis guineensis) biodiesel. Revista de biología tropical. Vol. 54, No. 1, pp: 59-63.
  18. Matta, H. and Punj, V., 1998. Isolation and partial characterization of a thermostable extracellular protease of Bacillus polymyxa B-17. International journal of food microbiology. Vol. 42, No.3, pp: 139-145.
  19. Maurer, K.H., 2004. Detergent proteases. Current opinion in Biotechnology. Vol.15, No.4, pp: 330-334.
  20. Naidu, K.S.B. and Devi, K.L., 2005. Optimization of thermostable alkaline protease production from species of Bacillus using rice bran. African Journal of Biotechnology. Vol.4, No.7, pp: 724-726.
  21. Padmapriya, B.; Rajeswari, T.; Nandita, R. and Raj, F., 2012. Production and purification of alkaline serine protease from marine Bacillus species and its application in detergent industry. European Journal of Applied Sciences. Vol.4, No.1, pp: 21-26.
  22. Patel, R.; Dodia, M. and Singh, S.P., 2005. Extracellular alkaline protease from a newly isolated haloalkaliphilic Bacillus sp.: Production and optimization. Process Biochemistry. Vol. 40, No. 11, pp: 3569-3575.
  23. Sawant, R. and Nagendran, S., 2014. Protease: an enzyme with multiple industrial applications. World J Pharm Sci. Vol. 3, pp: 568-579.
  24. Shah, K.; Mody, K.; Keshri, J. and Jha, B., 2010. Purification and characterization of a solvent, detergent and oxidizing agent tolerant protease from Bacillus cereus isolated from the Gulf of Khambhat. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. Vol. 67, No. 1-2, pp: 85-91.
  25. Sierecka, J.K., 1998. Purification and partial characterization of a neutral protease from a virulent strain of Bacillus cereus. The international journal of biochemistry & cell biology. Vol. 30, No. 5, pp: 579-595.
  26. Siezen, R.J. and Leunissen, J.A., 1997. Subtilases: the superfamily of subtilisin‐like serine proteases. Protein science. Vol. 6, No. 3, pp: 501-523.
  27. Valasaki, K.; Staikou, A.; Theodorou, L.G.; Charamopoulou, V.; Zacharaki, P. and Papamichael, E.M., 2008. Purification and kinetics of two novel thermophilic extracellular proteases from Lactobacillus helveticus, from kefir with possible biotechnological interest. Bioresource technology. Vol. 99, No. 13, pp: 5804-5813.
  28. Venugopal, M. and Saramma, A., 2007. An alkaline protease from Bacillus circulans BM15, newly isolated from a mangrove station: characterization and application in laundry detergent formulations. Indian journal of microbiology. Vol. 47, No. 4, 298 p.