بهینه سازی استخراجDNA از نمونه های جانوری موزه ای و قدیمی شامل پوست و استخوان پستانداران با روش اصلاحی فنل‌کلروفرم (‌مطالعه موردی: فوک خزر)

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه محیط زیست، دانشکده منابع طبیعی و علوم دریایی، دانشگاه تربیت مدرس، نور، ایران

2 مرکز حفاظت فوک خزری ایران، جزیره آشوراده، بندرترکمن، ایران

چکیده

 امروزه مطالعه DNA نمونه ­های موزه ­ای به­ دلیل اطلاعات مفیدی که دراختیار محققان قرار می ­دهد، از اهمیت خاصی برخوردار است. علاوه ­بر  ­این، از آن ­جا که محتوای ژنتیکی این نمونه­ ها به ­دلیل مرور زمان بسیار شکننده و بعضاً غلظت ­شان نیز بسیار اندک است، از گذشته تاکنون نیاز به­ روش‌ های موثرتر همراه با بازدهی بالاتری برای استخراج‌ کمی و کیفی مطلوب احساس می‌­ شد. از این ‌رو محققان بسته به گونه یا بافت هدف، اغلب با اصلاح و بهینه ‌سازی پروتکل‌ های استخراج به ­دنبال یافتن روش مناسبی برای تحقق اهداف­ شان هستند. در این مطالعه با تغییر بعضی پارامترها در روش فنول ‌کلروفرم محتوای ژنتیکی تعداد ۲۲ نمونه فوک ‌خزری که شامل بافت ‌های تازه و نمونه ‌های موزه‌ ای بودند استخراج گردید. هم­ چنین میانگین غلظت DNA بافت ‌های تازه و نمونه ‌های موزه‌ ای براساس میانگین و اشتباه معیار (M±SE) به ­ترتیب برابر با 182/91±632/90 و 75/62±226/87 نانوگرم بر میکرولیتر و میانگین نسبت جذبی طول موج ۲۶۰ به ۲۸۰ نانومتر در نمونه­ های تازه به 1/8 نزدیک ‌تر بود. محصول DNA نمونه‌ های حاصل از بافت عضله تازه به ­طور معنی ‌داری از غلظت بالاتری برخوردار بودند. سپس DNA حاصل با استفاده از دو آغازگر اختصاصی فوک ‌خزری (Hg6.3 و Hg8.9) با واکنش زنجیره ‌ای پلی ‌مراز پس از رسیدن به گرادیان دمایی مطلوب تکثیر ‌شدند. نتایج حاصل از مستند سازی باندهای مولکولی بر روی ژل آکریل‌آمید 8 درصد، حاکی از موفقیت ­آمیز بودن تکثیر همه نمونه‌ ها اعم از بافت ­های تازه و نمونه ­های موزه­ ای با حداقل 2 دهه قدمت بود. باتوجه به قابلیت ژنوتایپ موفق برای مطالعات ژنتیک جمعیت، حفظ نمونه ­های موزه ­ای تحت هر شرایطی توصیه می ­شود.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Optimization of DNA Extraction from Animal Museum Specimens Including Mammals' Skins and Bones with Modified Phenol-Chloroform Method (Case Study: The Caspian Seal)

نویسندگان [English]

  • Aria Khazaee 1
  • Seyed Mahmoud Ghasempouri 1
  • Amir Sayadshirazi 2
1 Department of Environmental Sciences, Faculty of Natural Resources and Marine Sciences, Tarbiat Modares University, Noor, Iran
2 Caspian Seal Treatment and Research Center, Ashooradeh Island, Bandar Torkaman, Iran
چکیده [English]

 The study of museum specimens' DNA, is so important today because of the useful information it provides researchers. In addition, because of the genetic content for these samples is very fragile over time and sometimes low in their concentration, they need to more efficient methods with higher yields for optimal quantitative and qualitative extraction needed from the past. Therefore, depending on the target species or tissues, researchers often search to find a suitable way to achieve their goals by modifying and optimizing extraction protocols. In this study, by changing some parameters in the phenol chloroform method, the genetic content of 22 Caspian Seal samples containing fresh tissues and museum specimens was extracted. Also, the average of DNA concentration of fresh tissues and museum specimens according to the mean and standard error (M±SE) was 632.90±75.62 and 222.87±182.91 respectively and the mean of 260/280 wavelength ratio was closer to 1.8 nm in fresh tissue samples, then the DNA product of fresh muscle tissue samples had significantly higher concentration (P-value<0.05). The extracted DNA was amplified using two specific non-universal primers (Hg6.3 and Hg8.9) by polymerase chain reaction upon achievement to suitable temperature gradient. The results of molecular band documentation on 8% acrylamide gel indicated that all specimens, both fresh tissue and museum specimens with at least two decades, were successfully amplified. Given the ability of a successful genotype for population genetic studies, preservation of museum specimens under any circumstances is recommended.

کلیدواژه‌ها [English]

  • DNA concentration
  • Museum tissue
  • Phenol-chloroform method
  • Caspian seal
  • Polymerase chain reaction

مراجع

  1. Anmarkrud, J.A. and Lifjeld, J.T., 2017. Complete mitochondrial genomes of eleven extinct or possibly extinct bird species. Molecular Ecology Resources. Vol. 17, No. 2, pp: 334-341.
  2. Avise, J.C., 2012. Molecular markers, natural history and evolution. Springer Science Business Media. 92 p.
  3. Bengtsson, C.F.; Olsen, M.E.; Brandt, L.Ø.; Bertelsen, M.F.; Willerslev, E.; Tobin, D.J. and Gilbert, M.T.P., 2012. DNA from keratinous tissue. Part I: hair and nail. Annals of Anatomy-Anatomischer Anzeiger. Vol. 194, No. 1, pp: 17-25.
  4. Buerki, S.; Callmander, M.W.; Bachman, S.; Moat, J.; Labat, J.N. and Forest, F., 2015. Incorporating evolutionary history into conservation planning in biodiversity hotspots. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. Vol. 370, No. 1662, pp: 20140014.
  5. Callow, J.A. and Ford Lloyd, B.V., 1997. Biotechnology and plant genetic resources: conservation and use, CAB International, University of Birmingham, U.K. 380 p.
  6. De Wit, M.Y.; Faber, W.R.; Krieg, S.R.; Douglas, J.T.; Lucas, S.B.; Montreewasuwat, N. and Hartskeerl, R.A., 1991. Application of a polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium leprae in skin tissues. Journal of clinical microbiology. Vol. 29, No. 5, pp: 906-910.
  7. Frankham, R.; Briscoe, D.A. and Ballou, J.D., 2002. Introduction to conservation genetics. Cambridge University Press. 257 p.
  8. Gemmell, N.J.; Allen, P.J.; Goodman, S.J. and Reed, J.Z., 1997. Interspecific microsatellite markers for the study of pinniped populations. Molecular Ecology. Vol. 6, No. 7, pp: 661-666.
  9. Ghaheri, M.; Kahrizi, D.; Yari, K.; Babaie, A.; Suthar, R.S. and Kazemi, E., 2016. A comparative evaluation of four DNA extraction protocols from whole blood sample. Cellular and Molecular Biology. Vol. 62, No. 3, pp: 120-124.
  10. Hagelberg, E. and Clegg, J.B., 1991. Isolation and charac terization of DNA from archaeological bone. Proceeding of Royal Society of London. Vol. 244, No. 3, pp: 45-52.
  11. Hofreiter, M.; Paijmans, J.L.; Goodchild, H.; Speller, C.F.; Barlow, A., Fortes, G. G. and Collins, M.J., 2015. The future of ancient DNA: Technical advances and conceptual shifts. BioEssays. Vol. 37, No. 3, pp: 284-293.
  12. Holden, M.J., 2003. Evaluation of extraction methodologies for corn kernel (Zea mays) DNA for detection of trace amounts of biotechnology-derived DNA. J of Agricultural and Food Chemistry. Vol. 51, No. 9, pp: 2468-2474.
  13. Höss, M. and Pääbo, S., 1993. DNA extraction from Pleistocene bones by a silica-based purification method. Nucleic Acids Research. Vol. 21, No. 16, pp: 3913.
  14. IUCN. 2017. Antelope Specialist Group.Hippotragus niger ssp. variani. The IUCN Red List of threatened species.
  15. Kennedy, S.; Kuiken, T.; Jepson, P.D.; Deaville, R.; Forsyth, M.; Barrett, K. and Kydyrmanov, A., 2000.  Mass die-off of Caspian seals caused by canine distemper virus. Emerging Infectious Diseases. Vol. 6, pp: 637-639
  16. Khazaee, M.; Hamidian, A.H.; Shabani, A.A.; Ashrafi, S.; Mirjalili, S.A.A. and Esmaeilzadeh, E., 2016. Accumulation of heavy metals and as in liver, hair, femur, and lung of Persian jird (Meriones persicus) in Darreh Zereshk copper mine, Iran. Environmental Science and Pollution Research. Vol. 23, No. 4, pp: 3860-3870.
  17. Lassen, C.; Hummel, S. and Herrmann, B., 1994. Comparison of DNA extraction and amplification from ancient human bone and mummified soft tissue. International Journal of Legal Medicine. Vol. 107, No. 3, pp: 152-155.
  18. Lemke, L.; Rex, M.; Zyprian, E. and Töpfer, R., 2011. A simple, inexpensive and environmentally friendly method for high throughput DNA extraction from grapevine (Vitis spp.). Vitis. Vol. 50, No. 1, pp: 7-10.
  19. Lickfeldt, D.W.; Hofmann, N.E.; Jones, J.D.; Hamblin, A.M. and Voigt, T.B., 2002. Comparing three DNA extraction procedures for cost, efficiency, and DNA yield. Hort Science. Vol. 37, No. 5, pp: 822-825.
  20. Mi, Y. and Vanderpuye, O., 2013. Comparison of different DNA extraction methods for forensic samples. Journal of Natural Sciences Research. Vol. 3, No. 11, pp: 32-38.
  21. Poljak, M.; Seme, K. and Gale, N., 2000. Rapid extraction of DNA from archival clinical specimens: our experiences. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. Vol. 439, No. 7, pp: R42-R44.
  22. Ruane, S. and Austin, C.C., 2017. Phylogenomics using formalin‐fixed and 100+ year‐old intractable natural history specimens. Molecular Ecology Resources. Vol. 17, No. 5, pp: 1003-1008.
  23. Sadeghi, M. and Sabouri, A., 2014. Optimization of the phenol -chloroform silica DNA extraction method in ancient bones DNA extraction. Journal of Knowledge & Health. Vol. 9, No. 2, pp: 21-26.
  24. Serrone, P.D., Attorri, L. and Palazzino, G., 2007. Easy DNA extraction for rapid detection of Panax ginseng CA Meyer in commercial ginseng products. Natural Product Research. Vol. 21, No. 12, pp: 1099-1103.
  25. Singh, A. and Bahuguna, A., 2014. Digging out treasure from museum specimen: A comparison of extraction methods and PCR polymerase enzymes for DNA from old taxidermy samples. International Journal of Advanced Research. Vol. 2, No. 9, pp: 700-707.
  26. Tsai, W.L.E.; Schedl, M.E.; Maley, J.M. and McCormack, J.E., 2019. More than skin and bones: Comparing extraction methods and alternative sources of DNA from avian museum specimens. Molecular Ecology Resources. Vol. 10, pp: 1-8.
  27. Wang, D.Y.; Eng, B.; Waye, J.S.; Dudar, J.C. and Saunders, S.R., 1998. Technical note: improved DNA extraction from ancient bones using silica-based columns. American Journal of Physical Anthropology. Vol. 105, pp: 539-543.
  28. Wood, H.M.; González, V.L.; Lloyd, M.; Coddington, J. and Scharff, N., 2018. Next-generation museum genomics: Phylogenetic relationships among palpimanoid spiders using sequence capture techniques (Araneae: Palpimanoidea). Molecular phylogenetics & evolution. Vol. 127, pp: 907-918.
  29. Yari, P.; Valiee, T.; Bashiri, H.; Kahrizi, D. and Yari, K., 2017. An efficient and optimized protocol for DNA extraction from animal tissues. Biological, Environmental and Agricultural Sciences. Vol. 2, No. 4, pp: 41-44.
فصلنامه محیط زیست جانوری
دوره 12، شماره 4
دی 1399
صفحه 25-32

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار