ساخت سازه RNA سنجاق سری القاءکننده خاموشی ژن و بررسی مقاومت ناشی از آن در برابر ویروس برگ بادبزنی مو GFLV

نوع مقاله : بیماری ها

نویسنده

گروه گیاه پزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه لرستان، خرم آباد، ایران

چکیده

 استفاده از ارقام مقاوم گیاهی بهترین راه برای کنترل عوامل ویروسی می ­باشد. القاء مقاومت به ­واسطه خاموشیRNA یک روش خوب برای ایجاد ارقام مقاوم به ویروس ­ها می­ باشد. ویروس برگ بادبزنی مو (GFLVGrapevine fanleaf virus) عامل یکی از مخرب­ ترین بیماری­ های ویروسی مو در سراسر دنیا است. به ­منظور بررسی امکان ایجاد مقاومت به GFLV مو با استفاده از سیستم القاء مقاومت به ­واسطه RNA، از توالی نوکلئوتیدی دو ژن این ویروس برای ساخت سازه سنجاق­ سری استفاده شد که در آن قطعه ­ای از هر ژن به ­طور جداگانه در جهت سنس و آنتی سنس در دو طرف یک ناحیه اینترونی و در مقابل 35SCaMV در پلاسمید pGA482G قرار گرفت. جهت تراریختیگیاهان Nicotiana benthamiana از سیستم Agrobacterium tumefaciens استفاده شد. پس از تأیید انتقال ژن، گیاهان تراریخت به ­منظور ارزیابی مقاومت نسبت به GFLV، مایه­ زنی مکانیکی شدند. 10 روز پس از مایه ­زنی ویروس سه نوع واکنش مقاومت، حساسیت و تأخیر در بروز علایم در گیاهان مایه ­زنی شده مشاهده شد. آزمون الایزا نیز عدم حضور ویروس را در گیاهان مقاوم تراریخت تأیید کرد. در این گیاهان حتی یک ماه پس از مایه­ زنی، هیچ ­گونه علایم ویروسی مشاهده نشد. درحالی­ که گیاهان تراریختی که حضور ویروس در آن­ ها با آزمون الایزا ردیابی شد، علایم موزاییک را یک هفته پس از مایه ­زنی و مشابه تیپ وحشی گیاهان مایه ­زنی شده با GFLV نشان دادند. نتایج این تحقیق نشان داد که سازه به ­کار رفته برای القاء مقاومت کارایی بالایی داشته و می ­توان از آن برای ایجاد مقاومت در ارقام مختلف مو نسبت به GFLV استفاده کرد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Construction of hairpin RNA structure inducing RNA silencing and evaluation of resistance derived by it against Grapevine Fanleaf Virus

نویسنده [English]

  • Samira Pakbaz
Plant Pathology Department, Faculty of Agriculture, Lorestan University, Khorram Abad, Iran
چکیده [English]

The most efficient approach to control virus agents is the use of the resistant plant varieties. The RNA silencing-based resistance is the best way to establish the resistant plants against viruses. Grapevine fanleaf virus (GFLV) is one of the most destructive viral diseases of grapevines worldwide. In order to investigate the possibility of the resistance induction against GFLV using RNA-mediated induction of resistance, nucleotide sequence of two genes of GFLV was used to produce a hairpin construct. The construct was developed using intron and also the fragments in sense and antisense directions in front of 35S promoter in pGA482G. Agrobacterium tumefaciens was used to transform Nicotiana benthamiana plants. To evaluate resistance to GFLV after confirmation of transformation, the transgenic plants were mechanically inoculated with this virus. 10 days after virus inoculation, the inoculated plants showed various reactions including resistance, susceptibility and delay in symptom production. ELISA assay confirmed the absence of the virus in the resistant transgenic plants. No symptom was observed in these plants even a month after inoculation. The transgenic plants in which the virus was detected by ELISA reaction, mosaic symptom similar to that in wild type plants was appeared one week after inoculation. The results of this study showed that the developed construct containing a sequence of GFLV is efficient to establish the resistance to this virus and could be applied to produce the resistance in the different grape varieties.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Transgenic
  • RNA silencing
  • Hairpin
  • GFLV

مراجع

  1. پاکباز، س.؛ پژوهنده، م.؛ عینی­ گندمانی، ا. و سخندان، ن.؛ 1397. القاء مقاومت به ویروس برگ بادبزنی مو (GFLV) به­روش.RNA Silencin  مجله پژوهش‌های سلولی و مولکولی. دوره 31، شماره 2، صفحات 268 تا 278.
  2. Bardonnet, N.; Hans, F.; Serghini, L. and Pinck, L., 1994. Protection against virus infection in tobacco plants expressing the coat protein of Grapevine fanleaf virus. Plant Cell Reports. Vol. 13, pp: 357-360.
  3. Baulcombe, D.C., 1996. Mechanisms of pathogen derived resistance to viruses in transgenic plants. Plant ell. Vol. 8, pp: 1833-1844.
  4. Dasgupta, V.; Malathi, G. and Mukherjee, S.K., 2003. Genetic engineering for virus resistance. Current Science. Vol. 84, pp: 3-10.
  5. Dawson, W. and Hilf, M.E., 1992. Host-range determinants of plant viruses. Annu Rev plant physiol plant Mol Biol. Vol. 43, pp: 527-555.
  6. Fuchs, M. and Gonsalves, D., 2007. Safety of virus-resistant transgenic plants two decades after their introduction: lessons from realistic field risk assessment studies. Annual Review of Phytopathology. Vol. 45, pp: 173-202.
  7. Gambino, G.; Perrone, I.; Carra, A.; Chitarra, W.; Boccacci, P.; Marinoni, D.; Barberis, M.; Maghuly, F.; Laimer, M. and Gribaudo, I., 2009. Transgene silencing in grapevines transformed with GFLV resistance genes: analysis of variable expression of transgene, siRNAs production and cytosine methylation. Transgenic Research. Vol. 19, No. 1, pp: 17-27.
  8. Gottula, J.; Berthold, F.; Labarile, R.; Gutting, H.; Demangeat, G.; Cantilina, K. K.; Vigne, E.; Marmonier, A.; Lemaire, O.; Ritzenthaler, C.; Schmitt-Keichinger, C. and Fuchs, M., 2014. Grapevine fanleaf virus and a virus-induced gene silencing and protein expression vector for Vitis spp. Dissertation of Doctor of Philosophy. 282 p.
  9. Jacqumond, M.; Teycheney, P.Y.; Carrere, I.; Navas Castillo, J. and Tepfer, M., 2001. Resistance phenotypes of transgenic tobacco plants expressing different Cucumber mosaic virus (CMV) coat protein genes. Molecular Breeding. Vol. 8, pp: 85-94.
  10. Jardak-Jamoussi, R.; Winterhagen, P.; Bouamama, B.; Dubois, C.; Mliki, A.; Wetzel, T.; Ghorbel, A. and Reustle, G., 2009. Development and evaluation of a GFLV inverted repeat constructfor genetic transformation of grapevine. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Vol. 97, pp:187-196.
  11. Kawchuke, L.M.; Martin, R.R. and Macpherson, P., 1991. Sense and antisense RNA mediated resistance to Potato leafroll virus in Russet Burbank potato plants. Molecular Plant-Microbe interaction. Vol. 4, pp: 247-253.
  12. Kerschen, A.; Napoli, C.A.; Jorgensen, R.A. and Muller, A.E., 2004. Effectiveness of RNA interference in transgenic plants. Federation of European Biochemical Societies Letters. Vol. 566, pp: 223-228.
  13. Kim, K.; Eamens, A. and Waterhouse, P., 2011. RNA Processing Activities of the Arabidopsis Argonaute Protein Family. RNA Processing. Vol. 8, pp: 137-156.
  14. Koteer, J.M.; Matzke, M.A. and Meyer, P., 1999. Listening to the silent genes: transgenic silencing, gene regulation and pathogen control. Trend Plant Science. Vol. 4, pp: 340-347.
  15. Lai-Kee-Him, J.; Schellenberger, P.; Dumas, C.; Richard, E.; Trapani, S.; Komar, V.; Demangeat, G.; Ritzenthaler, C. and Bron, P., 2013. The backbone model of the Arabis mosaic virus reveals new insights into functional domains of nepovirus capsid. Journal of Structural Biology. Vol. 182, pp:19-29.
  16. Lennefors, B.L.; Savenkov, E.I.; Bensefelt, J.; Wremerth, E.; Roggen, P.; Tuvesson, S.; Valkonen, J.P.T. and Gielen, J., 2006. dsRNA- mediated resistance to Beet necrotic yellow vein virus infections in sugar beet (Beta vulgaris L. ssp. vulgaris). Mol breeding. Vol. 18, pp: 313-325.
  17. Lindbo, J.A. and Dougherty, W.G., 1992. Untranslatable transcripts of Tobacco etch virus coat protein gene sequence can interfere with Tobacco etch virus replication in transgenic plants and protoplast. Virology. Vol. 189, pp: 725-733.
  18. Martelli, G.P., 2014. Directory of virus and virus-like diseases of the grapevine and their agents. Journal of Plant Pathology. Vol. 96, No. S1, pp: 1-4.
  19. Murashige, S. and Skoog, M., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiology. Vol. 15, pp: 473-497.
  20. Naraghi-Arani, P.; Duabert, S. and Rowhani, A., 2001. Quasispecies nature of the genome of Grapevine fanleaf virus. Journal of General Virology. Vol. 82, pp: 1791-1795.
  21. Palukaitis, P. and Carr, J.P., 2008. Plant resistance responses to viruses. Journal of Plant Pathology. Vol. 90, pp: 153-171.
  22. Reustle, G.; Winterhagen, P.; Jardak-Jamoussi, R.; Cobanov, P.; Dubois, C.; Manthey, T.; Wetzel, T.; Ghorbel, A.; Brendel, G.; Ipach, U. and Krczal, G., 2006. Resistance against nepoviruses: molecular and biological characterization of transgenic tobacco and grapevine plants. Extended abstracts of the 15th Meeting of ICVG, Stellenbosch 2006, pp: 59-60.
  23. Rovere, C.V. and Del vas, M.H.E., 2002. RNA mediated virus resistance. Current Opinion in Biotechnology. Vol. 13, pp: 167-172.
  24. Smith, N.A.; Singh, S.P.; Wang, M.B.; Stoutjesdijk, P.A.; Green, A.G. and Waterhouse, P.M., 2000. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature. Vol. 407, pp: 319-320.
  25. Vancanneyt, G.; Schmidt, R.; O'Connor-Sanchez, A.; Willmitzer, L. and Rocha-Sosa, M., 1990. Construction of an intron-containing marker gene:  Splicing of the intron in transgenic plants and its use in monitoring early events in Agrobacterium-mediated plant transformation. Molecular Genetics and Genomics. Vol. 220, pp: 245-250.
  26. Vazquez, R.C.; Del Vas, M. and Hopp, H.E., 2002. RNA- mediated virus resistance. Current Opinion in Biotechnology. Vol. 13, pp: 167-172.
فصلنامه محیط زیست جانوری
دوره 11، شماره 3
مهر 1398
صفحه 395-406

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار